【摘要】 目的观察珠子参多糖(Panax japlcus var Polysaccharide,PJPS)对小鼠H22肝癌移植瘤生长的抑制效应及其机制。方法分别建立BALB/c小鼠H22肝癌移植实体瘤模型及腹水瘤模型,将小鼠随机分为3组,即生理盐水组(阴性对照)、5-氟尿嘧啶组(阳性对照)、珠子参多糖组。给药结束后比较各用药组的抑瘤率、胸腺指数、脾指数、肿瘤组织细胞形态结构,肿瘤细胞超微结构、肿瘤细胞凋亡率、CD4+/CD8+值、外周血血清中血管内皮生长因子含量及生命延长率。结果珠子参多糖组的胸腺指数、脾指数、CD4+/CD8+值,外周血血清中血管内皮生长因子含量及生命延长率均高于5-氟尿嘧啶组,珠子参多糖组的抑瘤率及肿瘤细胞凋亡率低于5-氟尿嘧啶组,珠子参多糖组的部分肿瘤细胞有坏死现象及凋亡学形态变化。结论珠子参多糖对H22肝癌小鼠具有抑制肿瘤生长、延长生命的作用。提高机体细胞免疫功能,干扰肿瘤细胞周期,降低VEGF的表达可能是珠子参多糖发挥抗肝癌效应的机制。
【关键词】 珠子参; 多糖; 肝癌; 肿瘤抑制
Abstract:ObjectiveTo observe the anti-tumor activity of Panax japlcus var Polysaccharide (PJPS) on transplanted tumor H22 in mice and its mechanism.MethodsH22 transplanted solid hepatocarcinoma model and the ascites hepatocarcinoma model were established.The BALB/c mice were randomly divided into 3 groups:normal saline group(negative control group),5-fluorouracil group(positive control group),and PJPS group. After administration,the inhibitory rate of tumor,the thymus index ,the spleen index,tumor cell morphology,and ultrastructure,the rate of apoptosis of tumor cell,CD4+/CD8+ ratio,level of VEGF and the rate of life extension were determined. ResultsThe thymus index,spleen index,CD4+/CD8+ ratio,level of VEGF and the rate of life extension in PJPS group were higher than those of 5-FU group,but the inhibiting rate of tumor and the apoptosis rate of tumor cell were lower than those of 5-FU group.The tumor cells of PJPS group partly died . The tumor cell nucleus of PJPS group concentrated, and tumor cells got smaller. ConclusionPJPS can inhibit the growth of hepatoma carcinoma cells of H22 tumor-bearing mice. Improving the cellular immune function, interfering with tumor cell cycle and reducing the expression of VEGF may be the mechamisms of antitumor effect.
Key words: Panax japlcus var ; Polysaccharide ; Liver cancer; Tumor suppressor
珠子参Panax japlcus var,major又名扣子七,属五加科人参属植物,主要分布于东喜马拉雅至我国西部山区。其根茎为药材珠子参,具有活血散瘀,补血止血,消肿止痛之功。我们在早期的研究中发现珠子参水煎液有较好的抗肝癌作用[1,2],但珠子参多糖的抗肝癌作用尚未有相关报告。而目前对多糖的诸多研究表明其有很好的抗肿瘤活性[3~7]。本课题拟研究珠子参多糖治疗肝癌的作用机制,从而为开辟抗肝癌新药提供新的线索。
1 材料
1.1 动物及瘤株雄性BALB/c纯系小鼠,清洁级,6~8周龄,体质量(20±2)g,共80只,由湖北省实验动物中心提供,动物合格证号为:SCXK(鄂)2003-0005。小鼠肝癌H22瘤株(H22细胞)由三峡大学医学院免疫教研室提供。
1.2 药品及试剂珠子参:购于宜昌市沿江中药房,经宜昌市药检所鉴定,产地:神农架,批号:200703;5-氟尿嘧啶(5-FU)针剂:上海旭东海普药业有限公司,批号:20070123,灭菌生理盐水稀释至一定浓度,避光常温保存;Mouse VEGF ELISA Kit:上海船夫生物科技有限公司;小鼠CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/CD8-PE:苏州生物基因有限公司;RPMI-1640培养液:Gibco公司,批号:1342878。
2 方法
2.1 药物及试剂制备
2.1.1 珠子参多糖水提醇沉法提取珠子参粗多糖,经活性炭脱色、链霉蛋白酶-Sevag法除蛋白、透析袋去除小分子杂质后得到珠子参精制糖。
2.1.2 5-FU在超净工作台避光条件下,无菌生理盐水稀释5-FU针剂至一定浓度后分装于EP管并用锡纸遮盖保存于4 ℃冰箱。
2.2 动物模型的制作将浓度为5.0×106个/ml的肝癌细胞悬液注射至健康BALB/c小鼠右腋皮下,每只0.2 ml,建立实体瘤模型;按上法小鼠腹腔内接种H22细胞悬液建立腹水瘤模型。
2.3 动物分组及给药造模后随机分组,每组10只小鼠。从第2天起分组给药:生理盐水组(normal saline,NS)(阴性对照):灌胃0.2 ml生理盐水+腹腔注射0.2 ml生理盐水,1次/d,连续给药11 d;5-氟尿嘧啶组(5-fluorouracil,5-FU)(阳性对照):腹腔注射0.2 ml 5-FU+灌胃0.2 ml生理盐水,剂量为25 mg/kg体重,隔日1次,共6次。间隔期间以生理盐水替代5-FU腹腔注射;珠子参多糖组(panax japlcus var polysaccharide,PJPS):灌胃0.2 ml珠子参多糖+腹腔注射0.2 ml生理盐水,1次/d。剂量为50 mg/kg体质量,连续给药11 d。
2.4 指标测定
2.4.1 抑瘤率给药结束后实体瘤模型眼球取血处死小鼠,计算公式如下:抑瘤率(%)=(1-实验组肿瘤质量模型组肿瘤质量)×100%
2.4.2 胸腺指数及脾指数无菌条件下剥离小鼠胸腺及脾脏,称重。按下列公式计算胸腺指数及脾指数:胸腺指数=胸腺重量(mg)小鼠重量(g)脾指数=脾重量(mg)小鼠重量(g)
2.4.3 观察肿瘤组织细胞形态结构的变化取各组小鼠肿瘤组织,10 %甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肿瘤生长、坏死及对周围组织的浸润等情况。
2.4.4 观察肿瘤细胞超微结果的变化经取材、固定、脱水、浸透、包埋和切片染色后用于透射电子显微镜观察。
2.4.5 肿瘤细胞周期分析利用PI标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,分析细胞周期各时相的百分比及凋亡细胞所占比例。
2.4.6 T细胞亚群的检测利用流式细胞仪检测小鼠脾脏中CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+ T细胞亚群数量。